تکنیک های استریل و کشت آگار در تولید قارچ های خوراکی

تولید قارچ با روش کشت آگار

هوایی که از آن تنفس می کنیم مملو از موجودات بسیار ریز است که با باد به حرکت در می آیند. قارچها، باکتریها، ویروسها و گیاهان برای انتقال گرده های خود به مناطق دیگر از باد کمک می گیرند. در صورت عدم رعایت نکات بهداشتی، این ذرات می توانند چه در تهیه کشت خالص و چه در فرآیند تولید قارچ خوراکی خلل وارد نمایند.

به طور کلی منابع اصلی آلاینده محیط کشت عبارتند از:

محیط اطراف
ظروف کشت
ادوات و ابزار کشت
پرورش دهنده و لباس وی
هاگ ها یا میسلیوم قارچ خوراکی

قارچ ها و تمامی موجودات زنده نسبت به مواد غذایی، رقابت تنگاتنگ و دائمی با یکدیگر دارند. هدف از ایجاد یک محیط استریل، حذف یا کاهش این گونه رقابت و درنهایت فراهم ساختن شرایط مناسب برای تکثیر قارچ خوراکی می باشد. اولین مرحله قبل از تهیه کشت خالص، احداث اتاقک تلقیح یا آزمایشگاه استریل است.

طراحی و احداث آزمایشگاه استریل

علت عمده شکست بیشتر پرورش دهندگان قارچ، عدم صرف وقت کافی به منظور احداث آزمایشگاه استریل است. کاری که چندان هم وقت و انرژی نمی برد، بلکه فقط یک و نیم روز کافی است تا یک انباری کوچک یا یک آبدارخانه را به یک اتاقک تلقیح مفید تبدیل کرد.

برای شروع تمام قالیچه ها، پتوها، پرده ها و دیگر مواد پارچه ای را که پناهگاه خوبی برای گرد و غبار و هاگ های مضر می باشند از محل دور کرده و تمامی دیوارها و سقف را با یک ماده ضد عفونی کننده کاملا تمیز کنید.

اتاق را با یک رنگ روغنی براق یا اپوکسی بهداشتی رنگ زده تا شستشوهای بعدی راحت تر گردد. پنجره ها یا هر منبع ورودی هوا را با یک پوشش پلاستیکی مناسب بپوشانید.

محل ورودی اتاق را با پلاستیک یا هر ماده دیگر بصورت یک محفظه انتظار در آورده تا مانع جریان مستقیم هوا به درون اتاق گردد و طراحی این محفظه باید به گونه ای باشد که هنگام ورود به آن، درب آزمایشگاه بسته باشد.

تجهیزات آزمایشگاه استریل استاندارد

تجهیزات ذیل در هر آزمایشگاه استانداردی ضروری است:

صندلی و میز محکم با سطح کاملا صاف.
چراغ الکلی، چراغ بنسن یا یک شعله معمولی گاز بوتان برای تولید حرارت
بطری اسپری حاوی محلول سفید کننده ۱۰ %
تعدادی پتری دیش استریل و لوله آزمایش.
تعدادی برچسب، یک دفتر و خودکار.
یک چاقوی آگار و حلقه تلقیح
یک دستگاه اتوکلاو یا زودپز معمولی (بخار تحت فشار).
pH سنج یا کاغذ تورنسل معمولی.
الکل ۹۶٪ و دیگر مواد ضد عفونی همچون وایتکس، فرمالین …
قفسه برای ظروف کشت، جا لوله ای و …

تمامی این اجزاء بایستی درون آزمایشگاه بماند و در صورت خروج یکی از آنها به بیرون، هنگام برگشت آن به داخل آزمایشگاه باید از تمیز بودن آن، مطمئن شد.

رعایت اصول کلی طراحی یک آزمایشگاه

به طور کلی برای طراحی یک آزمایشگاه باید علاوه بر تجهیزات و وسایل گفته شده اصول زیر نیز در نظر گرفته شود:

اتاق تهیه محیط کشت که دارای تجهیزات کامل و قفسه های متعدد است (۳۵% مساحت کل)
اتاقک شیشه ای استریل (محفظه تلقیح) (۱۵٪ مساحت کل)
اتاق کشت (۴۰٪ مساحت کل)
بقیه مساحت برای نگهداری وسایل، اتوکلاو، ترازوها، یخچال و انبار میسلیوم و اسپان مادری (حدود ۱۰٪)

با روش ساده ای می توان آزمایشگاه یا محیطی نیمه استریل، بسته به حجم استفاده و دفعات کاری ایجاد کرد. درصد پاکی لازم برای اتاق استریل تابع مقدار هاگ محیط بیرون است.

به عنوان مثال، در فصل زمستان با سرد شدن هوا، مقدار هاگ و آلاینده های هوا تا حد زیادی کاهش یافته، حال آن که در طول تابستان و بهار این مقدار بسیار زیاد می باشد.

بنابراین لازم است در طی این دو فصل توجه کافی به استریل بودن محیط آزمایشگاه مبذول گردد. نکته مهم دیگر این که، تمامی ظروف و بطری های شیشه ای آلوده را باید به طریقی از بین برد تا ضریب آلودگی محیط آزمایشگاه به حداقل برسد.

اصول و نکات بهداشتی بعد از احداث اتاق استریل

بعد از احداث اتاق استریل باید یک سری اصول و نکات بهداشتی را کاملا رعایت نمود. به این صورت که اتاق استریل را باید با یک محلول سفید کننده (آب ژاول) کاملا تمیز کرد و کف را طی کشیده و در پایان هوای اتاق را با یک محلول سفید کننده ۱۰٪ و با استفاده از یک سمپاشی پشتی یا اسپری ضدعفونی کنیم.

حداقل تا ۱۵ دقیقه بعد از محلول پاشی نباید وارد اتاق شد. در هر مرحله از تلقیح و کشت این عملیات باید تکرار شود، چرا که همواره پیشگیری آسانتر و بهتر از درمان است.

استریل نمودن و استریل نگاه داشتن محیط مستلزم توجه زیاد همراه با کمک و یاری مداوم دیگران است. این امر وقت گیر بوده و نباید سرسری و مقطعی انجام گیرد. هرگز یک چراغ الکلی یا شعله گاز را درون اتاق یا محفظه تلقیح روشن نگذارید، چرا که در یک محیط بسته اکسیژن هوا به زودی تمام می شود.

نکات مهم در مورد بکارگیری بی رویه مواد شیمیائی در محیط آزمایشگاهی

بعضی از پرورش دهندگان، بیش از نیاز لازم بهداشتی با آلودگی مقابله می نمایند. بدین ترتیب این افراد آزمایشگاه و در نهایت سلامتی خود را با مصرف وسواسی و افراطی قارچ کشها، باکتری کشها و ضدعفونی کننده های شیمیائی جهش زای خطرناک به خطر میاندازند.

به طور مثال می توان به عوارضی همچون تنگی نفس، بی حسی های شدید همراه با تشنج های مداوم که گاه تا چندین روز نیز به درازا می انجامد که بر اثر کار طولانی مدت افراد، بلافاصله در اتاق هائی که مدت چندانی (کمتر از ۱۵ دقیقه) از سمپاشی آنها بالاخص با سموم فنلی نگذشته اشاره کرد.

یا از بین موارد متعدد دیگر، ابتلاء به سرطان پوست بواسطه تماس طولانی (چند سال) و مستقیم پوست (بدون پوشش ایمنی با اشعه ماورای بنفش (UV) در حین استریل کردن نمونه ها داخل محفظه شیشه ای درون اتاق تلقیح اشاره نمود.

راه کارهای کاربردی برای استریل کردن محیط از آلودگی ها

چنانچه علیرغم تلاش فراوان در جهت استریل کردن محیط آلودگی باز هم در محیط باقی بماند در آن صورت می توان از راه کارهای ذیل استفاده کرد:

بخور روغن استریل کننده مانند تری اتیلن گلایکول با گرم کن فتیله ای در فضای اتاق که ابری از قطرات بسیار ریز و نسبتا سنگین در هوا ایجاد شده که ضمن پائین آمدن ذرات آلاینده معلق در هوا را جذب کرده و از بین می برند.
احداث نوعی محفظه شیشه ای کاملا مسدود و نیمه استریل برای نقل و انتقال و کارهای کشت بافت که می توان آنها را از چوب و پنجره ای کوچک برای نگاه کردن درون آن ساخت که در یک طرف آن دو سوراخ لاستیکی مخصوص تعبیه می نمایند تا هنگام کار، فرد بتواند دستان خود را داخل محفظه کرده و در صورت عدم استفاده، ورودی سوراخها با لفافهای پوشیده می شود. مزیت عمده این محفظه ارزان بودن استریل کردن آسان محیط داخل آن و عدم جریان مستقیم هوا به درون آن در ضمن کار می باشد.
استفاده از صافی های بسیار ریز که قطر چشمه های آن 0/3-0/1 میکرون بوده و از قطر هاگهای مضر بعضی قارچها و حتی از باکتری ها نیز کوچکتر است. از این صافی ها در سامانه های مخصوصی به نام هود تهویه ملایم استفاده می نمایند. در برخی از آزمایشگاه های پیشرفته تمام استریل، درون دیوارها یا سقف نیز از این نوع صافی ها استفاده شده و هوای ورودی اتاق با عبور از میان آنها تصفیه می شود.

آلودگی، ممکن است در یک محل کم و در جای دیگر زیاد باشد و یا در یک مرحله از پرورش طغیان نماید یا این که علی رغم چند سال فعالیت، اثری از آن دیده نشود.

از طرفی باید توجه داشت که نوع آلودگی، در مراحل و مکان های مختلف یکسان است، اما شدت و ضعف آن بسته به یک سری عوامل مختلف داخلی یا محیطی متفاوت است که با اعمال یک سری تمهیدات و اصول بهداشتی تا حدی می توان آن را کنترل کرد.

آماده کردن محیط کشت مغذی آگار

پس از تکمیل آزمایشگاه نوبت به تهیه محیط کشت مغذی آگار می رسد. آگار، محصولی است که از نوعی جلبک دریایی بدست آمده و برای سفت کردن محیط کشت بکار می رود و از نظر ظاهری بسیار شبیه ژلاتین است اما از نظر کارکرد، به مراتب از آن سودمندتر است.

در زمینه تولید محیط کشت آگار غنی شده که مناسب قارچهای خوراکی باشد، فرمول های متعددی وجود دارد که از این میان می توان به فرمول های استاندارد (PDA (Potato Dextrose agar و (MEA (Malt Extract Agar همراه با مکمل خمیر مایه اشاره کرد.

در بسیاری از مجلات قارچ شناسی، فهرستی از انواع محیط های کشت آگار حاوی پپتن و نئوپپتن (دو منبع سرشار از پروتئین مورد نیاز میسلیوم) ارائه شده است.

محیط کشتی که متخصصین توصیه می کنند، مخلوطی از دانه های جوشانده شده گندم یا چاودار غنی شده با شیره مالت است. برای افزایش رشد می توان به محیط کشت زایلوز و ۱- آرابینوز از قندهای پنج کربنه پنتوزی متبلور) اضافه کرد. از جمله مواد لازم دیگر برای محیط کشت می توان، کلسیم، بیوتین، تیامین، اسیدهای آمینه اسپاراژین، آلانین و گلایزین را نام برد.

سه فرمول مغذی آگار برای رشد انواع مختلف قارچ های خوراکی

آنچه در ادامه می بینید سه نوع فرمول مغذی آگار است که هر کدام از آنها برای رشد میسلیومهای انواع مختلف قارچ خوراکی همچون: دکمه ای، صدفی، شیتاکه، استروفاریا، چینی، پانالوس و سیلوسب استفاده می شود که از بین آنها، ۲ محیط (PDY(Potato Dextrose Yeast و (MPG(Malt Peptone Grain مورد توجه می باشند.

توصیه میشود برای افزایش رشد میسلیوم ها به هر محیط، مقداری پودر چاودار و یا عصاره آن افزوده شود. بعد از انتخاب هر یک از فرمول های زیر ترکیبات آن را بصورت خشک با هم مخلوط کرده، درون یک فلاسک ریخته و در نهایت با افزودن آب، حجم مخلوط را به یک لیتر برسانید.

چند نمونه از محیط کشت های مهم

چند نمونه از محیط کشت های مهم که امروزه کاربردهای زیادی دارند عبارتند از:

آگار PDY (مخمر دکستروز سیب زمینی) که شامل عصاره صاف شده ۳۰۰ گرم خلال سیب زمینی که در یک لیتر آب تا یک ساعت جوشیده باشد.۱۰ گرم قند (گلوکز راست گرد) (قند دکستروز).۲ گرم مخمر (اختیاری) و ۲۰ گرم آگار
آگار MPG (مخلوط بذر- پپتین – مالت) که شامل ۲۰ گرم مالت عسلی رنگ. ۵ گرم پودر بذر چاودار. ۵ گرم پپتین یا نئوپپتن. ۲ گرم مخمر (اختیاری) و ۲۰ گرم آگار
آگار MEA (آگار عصاره مالت) که شامل۲۰ گرم مالت عسلی رنگ. ۲ گرم مخمر و۲۰ گرم آگار

نکات بسیار مهم در تهیه محیط کشت قارچ ها

در تهیه محیط کشت، رعایت نکات زیر ضروری است:

1.pH محیط کشت : گونه های متفاوت قارچ برای رشد و نمو در محیط کشت، pH خاص خود را می طلبند. بطوری که pH مطلوب برای گونه های سیلوب ۷-۶ می باشد، در حالی که این مقدار برای نوع دکمه ای 6/5-7 می باشد.

اکثر گونه ها، نسبتا مقاوم بوده و بخوبی در دامنه 5/5-7/5 رشد می نمایند. pH کمتر از 4/5 و بالاتر از ۷ باعث توقف رشد و نمو (هاگ ها و میسلیومها) می گردد و چنانچه pH محیط خیلی پائین باشد، محیط کشت رقیق می شود و باید محیط تازه با pH مطلوب آماده شود.

pH، بعد از اتوکلاو کردن تا 0/4 واحد کاهش می یابد. چنانچه در حین تهیه محیط کشت، pH خیلی پایین یا بالا رود، می توان به ترتیب آن را با NaOH یا HCI رقیق (۱ تا 0/1مولار)، تعدیل کرده سپس محیط کشت را کاملا هم زده و pH آن را با یک pH سنج یا کاغذ تورنسل معمولی می سنجیم.

2.ضدعفونی محیط کشت: این کار معمولا به دو روش صورت می گیرد. اول با مواد شیمیایی: مانند الکل ۷۰٪، هیپوکلریت سدیم (وایتکس) ۱٪ و بالاخص آنتی بیوتیکها. در هر صورت ساده ترین راه، استفاده از مواد گیاهی غیر آلوده است.

جهت کنترل باکتریها در محیط کشت، 0/1 گرم از محلول سولفات جنتامایسین ۸۰-۶۰% را قبل از عمل اتوکلاو کردن باید به هر لیتر از این محیط ها اضافه کرد. همچنین می توان از نوع دیگر آنتی بیوتیک بنام استرپتومایسین بعد از استریل کردن محیط کشت استفاده کرد.

در مجموع باید از آنتی بیوتیکها بصورت موقتی و به مقدار بسیار اندک بهره جست چون غلظت بالای آنها، مانع رشد و نمو بعضی گونه ها و از طرف دیگر ایجاد مقاومت در باکتریها می شود.

و دوم با بخار: بعد از اختلاط کامل ترکیبات محیط کشت و در صورت باقی ماندن اثرات باکتری بعد از ضدعفونی شیمیایی (آنتی بیوتیکها) می توان برای رفع هر گونه آلودگی با بخار تحت فشار، محیط کشت را استریل و یا به اصطلاح اتوکلاو کرد.

اتوکلاو یا استریل کردن ظرف کشت

استریل کردن صحیح، بستگی به زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده مورد استریل دارد. در شرایط عادی می توان محیط کشت آماده را داخل ارلن پیرکس (به علت دهانه تنگ آن میزان تهویه، خشک شدن و ضریب آلودگی کاهش می یابد) ریخته درب آن را با یک فویل آلومینیومی پوشاند.

دقت کنید که حجم آگار درون ارلن نباید از دو سوم تا سه چهارم حجم کل ظرف بیشتر شود. ظرف کشت را داخل اتوکلاو یا زودپز معمولی قرار داده و به زودپز را یک سانتی متر آب مقطر بریزید تا بخار لازم تأمین شود. طبق دستورالعمل شرکت سازنده، درب زودپز را کاملا بسته آن را حرارت دهید تا بخار فراوان تولید کند.

قبل از بستن سوپاپ اطمینان بخار، بگذارید تا بخار آن به مدت ۴ تا ۵ دقیقه خارج شود. به آرامی فشار را به ۱۵ پوند رسانده و ۳۰ دقیقه در همین فشار نگهدارید.

توجه کنید دمای ظرف از 121 درجه سانتی گراد فراتر نرود، در غیر این صورت قند موجود در محیط کشت، سوخته و به اصطلاح کارامل می شود که در نتیجه آن، رشد میسلیوم متوقف شده و یکسری جهش های ناخواسته ژنتیکی پدیدار می شود.

از طرفی اتوکلاو کردن بیش از ۳۰ دقیقه باعث ته نشین شدن املاح مفید (بخصوص K) و تجزیه اگار می شود. هم چنین باید ظروف خالی شیشه ای و کاغذها را بطور جداگانه به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۱۳۰ سانتی گراد (بصورت خشک) استریل کرد.

رابطه بین ارتفاع و نقطه جوش و نیز فشار و دما

طبق قانون بویل – ماریوت، در حجم ثابت، دما و فشار رابطه مستقیمی با یکدیگر دارند. فشار هوا را معمولا نسبت به سطح استاندارد دریا محاسبه کرده و هر چه از سطح دریا بالاتر می رویم فشار هوا کمتر می شود.

لذا در ارتفاعات بالاتر، متناسب با مقدار ارتفاع از سطح دریا، باید فشار اتوکلاو یا زودپز را افزایش دهیم تا خللی در عمل استریلیزاسیون وارد نشود. به شرح ذیل نسبت های بین پارامترهای دما، فشار هوا، و تغییرات نقطه جوش آب در ارتفاعات مختلف را می بینید.

بعنوان مثال در ارتفاع حدود ۱۵۰۰ متری از سطح دریا، نقطه جوش آب نسبت به سطح دریا تقریبا 4/5-5 درجه سانتی گراد کاهش می یابد ( 95 درجه سانتیگراد) و از طرفی در این ارتفاع، فشار هوا ۵ پوند یا تقریبا 0/4 اتمسفر نسبت به سطح دریا افزایش می یابد( 1/4 اتمسفر).

در نتیجه با توجه با این که نباید دمای داخل اتوکلاو را به سبب بروز تغییرات شیمیایی مواد داخل آن افزایش دهیم، به ناچار مجبوریم، فشار را به میزان 0/4 آتمسفر (۵ پوند) بالا ببریم تا جبران ۵ درجه اختلاف دما را در این ارتفاع با توجه به حجم ثابت مواد درون اتوکلاو کنید.

توجه کنید استریلیزاسیون در فشار 1/05kg/ cm2 به مدت یک ساعت دارای نتایج مشابهی با استریلیزاسیون در فشار 2kg/ 2cm به مدت ۳۰ دقیقه (یعنی دو برابر کردن فشار و نصف کردن مدت زمان دارد.

مسأله مهم در این جا این است که اکثر زودپزها تحمل این فشار را ندارند و باید حتما قبل از استفاده به برچسب کنترل کیفی روی زودپز توجه شود.

قرارگیری پتری دیش های حاوی آگار در محیط آزمایشگاه

بعد از اتمام استریل کردن، زودپز را در آزمایشگاه یا یک اتاق نیمه استریل قرار داده، اجازه دهید تا قبل از باز کردن درب آن، فشار به یک پوند( 0/07kg/ cm2) کاهش یابد. سپس درب آن را باز کنید و اقدام به ریختن آگار در پتری دیشها کنید.

باید دانست با هر لیتر از محلول آگار بدست آمده می توان ۳۰ پتری دیش ۱۵×۱۰۰ میلی متر را پر کرد. چنانچه با محدودیت فضای میز کار مواجه هستید، می توانید پتری دیشها را پس از پر کردن، یک به یک روی هم بگذارید در غیر این صورت می توانید هر یک از پتری دیشها را در کنار هم قرار دهید و دامنه کار خود را توسعه دهید.

پیش از پر کردن پتری دیش ها، محلول کشت را به شدت تکان دهید تا محتویات آن خوب پخش شده مخلوطی همگن بدست آید. سپس بگذارید تا آگار خنک شده و یکنواخت گردد و سپس اقدام به پر نمودن پتری دیش ها کنید تا بدین وسیله از تعریق جدار داخلی ظروف که از ریختن محلول آگار گرم ناشی می شود، جلوگیری شود. اکنون این محلول آماده کشت هاگ یا بافت زنده می باشد.