تکثیر جنسی یا کشت هاگ (Spore culture) در قارچ ها
کشت خالص به منظور تهیه اسپان مورد نیاز برای تکثیر قارچ خوراکی را به دو روش می توان تهیه نمود. کشت هاگ، که به نوعی می توان آن را تکثیر جنسی نامید و دارای تفریق صفات و تنوع بالای نتاج حاصله از نظر کیفیت و کمیت محصول می باشد.
از این روش بیشتر برای تهیه بذر قارچ استفاده می شود. روش دوم کشت بافت زنده یا به اصطلاح تکثیر غیر جنسی و یا کلونینگ” می باشد. این روش به علت شباهت بالای نتاج تولیدی با والدین، بیشتر در تکثیر قارچ هایی که از نظر کیفیت و کمیت محصول در حد مطلوبی هستند استفاده می شود.
پرورش دهندگان قارچ، کشت هاگ را بدلیل راحتی اجرا و ماندگاری بالای هاگ ها حتی تا ماهها بعد از تجزیه کلاهکها ترجیح می دهند. اما ماندگاری کلاهکها یا بافت زنده بسیار کم است (۱ تا ۲ روز) و باید بلافاصله بعد از چیدن بافت، اقدام به کشت نمود.
چگونه هاگ یا اسپور را از قارچ سالم بدست آوریم؟
مرحله اول در کشت هاگ، جمع آوری مقداری هاگ (نقش اسپور) از قارچ های سالم و مناسب می باشد. بدین منظور کلاهک سالم، تازه و کاملا تمیزی را از ساقه جدا کرده و بطور واژگون روی یک کاغذ سفید یا سطح شیشه ای تمیز (اسلاید میکروسکوپ) یک تا دو ساعت می گذاریم.
چنانچه کلاهک موردنظر خشک باشد، جهت رهاسازی آسانتر هاگ یک دو قطره آب مقطر به آن زده و برای جلوگیری از کاهش تبخیر و جریان هوای مستقیم، یک بشر بر روی آن می گذاریم. پس از چند ساعت که هاگها، کاملا رها شد و نقش تیغه ها روی کاغذ افتاد، کاغذ هاگ ها را بریده از وسط تا می زنیم و در یک ظرف کاملا در بسته گذاشته و روی آن را بر چسبی حاوی زمان جمع آوری، گونه قارچ و شماره جمع آوری می زنیم.
در صورت جمع آوری هاگها روی لامل میکروسکوپ، کافیست هاگ ها را ما بین دو لامل قرار داده دور تا دور لبه این دو لامل را با نوار چسب بچسبانیم تا از نفوذ هاگ های آلاینده، ایمن شود. در صورتی که در جمع آوری و نگهداری هاگ ها دقت کافی نشود، محیط کشت هاگ آلوده شده و امکان به دست آوردن یک کشت خالص نیز کاهش می یابد.
انتخاب نمونه سالم از قارچ ها
قارچ های دکمه ای و سیلوسب و بسیاری دیگر از گونه های خوراکی، در ایام جوانی دارای یک غشاء نازک موسوم به پرده کوچک می باشند. این پرده از لبه کلاهک تا ساقه کشیده شده و از هاگ ها در برابر شرایط نامساعد محیطی و آلاینده ها حفاظت می کند.
هنگام انتخاب نمونه سالم و جوان سعی کنید قارچ هایی را انتخاب کنید که پرده آنها پاره نشده باشد، که در این صورت می توانید با برداشتن دقیق و استریل این پرده به هاگ های خالص تری دست یابید.
تکنیک های تلقیح و جوانه زنی هاگ قارچ خوراکی
پس از تهیه هاگ های لازم و مطلوب می توان کشت هاگ را آغاز کرد. بدین ترتیب که ابتدا حلقه تلقیح با تیغ جراحی را با حرارت شعله به مدت ۵ تا ۱۰ ثانیه استریل کرده سپس آن را داخل یک پتری دیش حاوی محیط کشت استریل فرو کرده و می گذاریم کمی خنک شود.
آنگاه بوسیله آن، هاگ ها را کم کم از روی کاغذ برداشته و بصورت خط خط یا زیگزاگ بر روی سطح آگار پخش می نماییم. جهت افزایش شانس موفقیت جوانه زنی هاگ ها، می توان بطور همزمان و سریع سه پتری دیش را با هم تلقیح کنیم که به این روش اصطلاح کشت چندگانه یا توده ای هاگ می گویند.
به مرور زمان که از تلقیح می گذرد، هاگ ها رطوبت جذب کرده متورم شده و درصد جوانه زنی آنها افزایش می یابد. چنانچه به رطوبت کافی دست نیابند، چروکیده و به سهولت جوانه نخواهند زد که در این حالت می توان با مرطوب کردن هاگ های خشک با آب استریل، جوانه زنی آنها را بهبود بخشید.
رطوبت دهی به هاگ ها برای کشت
برای مرطوب کردن هاگ ها، بهتر است از ابزار مناسب همچون قطره چکان چشمی، پیپت یا سرنگ آمپول، یک لوله آزمایش پر از آب مقطر یا یک فلاسک ارلن مایر به حجم ۲۵۰-۲۵ سانتیمتر مکعب که درب آن را با پنبه بسته و روی آن را با یک فویل آلومینیومی کاملا مسدود نمایید.
در شرایط 0/07 کیلوگرم بر سانتی متر مربع و به مدت ۳۰ دقیقه با دمای 121 درجه سانتیگراد کاملا استریل شده اند استفاده کنید. بعد از این مرحله با دقت مقداری هاگ را با تیغ جراحی استریل از محیط کشت برداشته و درون آب مقطر از قبل تهیه شده بریزید و آن را محکم بسته و ۶ تا ۱۲ ساعت در مکانی ساکن بگذارید.
پس از این مدت، چند میلی لیتر از این محلول حاوی ها را با قطره چکان استریل برداشته و چند پتری دیش را با یکی دو قطره از آن، تلقیح کنید و آماده مراحل بعدی باشید.
خصوصیات میسلیوم قارچ خوراکی بعد از جوانه زنی
۳ تا ۷ روز بعد از تلقیح، هاگ ها شروع به جوانه زنی کرده و بصورت رشته های سلولی نخ مانند (هیف) منشعب از یک نقطه مرکزی در سطح محیط کشت ظاهر می شوند و به سرعت با گسترش این رشته ها و درهم رفتن آنها، شبکه میسلیومی بوجود می آید.
شبکه میسلیومی در ابتدا به صورت غیر مستقیم و به رنگ خاکستری بوده و بعد از مدت بسیار اندک با تقسیم و تکثیر هیف های بیشتر و گسترش آنها درون محیط کشت، به رنگ سفید در می آیند.
رنگ میسلیوم اکثر گونه ها بویژه دکمه ای، شی تاکه، قارچ رقیب کلاهکدار، پانالوس و سیلوسب خاکستری مایل به سفید است. در گونه های دیگر همچون lepista nuda آبی مایل به ارغوانی و گونه ای خاص از سیلوسب، قهوه ای می باشد. در مجموع، تنوع رنگ تابع نژاد قارچ، روش تکثیر و محیط رشد می باشد.
از دیگر خصوصیات ظاهری میسلیوم می توان به نوع رویش آن اشاره کرد که از این نظر به انواع مختلف هوایی، مسطح، پنبه ای یا ریشه مانند دیده می شود. میسلیوم هوایی در گونه های مرطوب زی دیده می شود، حال آن که میسلیوم مسطح، بیشتر در شرایط خشک دیده می شود.
چگونه کلونی ساخته می شود؟
به رشد میسلیوم از محل تلقیح واحد و ظهور انواع انشعابات مختلف الشکل را در اصطلاح، کلونی یا پیکربندی گفته می شود. هر کلونی را تنها در مقایسه با کلونی میسلیومی مجاور آن می توان تشخیص داد. انواع عمده کلونی های میسلیومی عبارتند از ریشه ای و پنبه ای. البته نوع حد واسط این دو نوع نیز وجود دارد.
بدین ترتیب که مثل ریشه ای به شکل شعاعی می روید اما بر خلاف آن به هم تابیده و ضخیم نبوده که خطی و تار مانند است. میسلیوم ریشه ای بیشتر مستعد تولید پریموردیوم است، میسلیوم خطی نیز توان تولید پریموردیوم فراوان را دارد اما باید به شکل ریشه ای تبدیل شود.
کلونی ها عموما در محیط های کشت قارچ دیده می شوند و هر چند اطلاعات ما درباره علت پیدایش و کارکرد آن کم است. اما بدیهی است که ژنتیک، تغذیه و سن میسلیوم نقش مهمی ایفا می کنند. پس از شناخت نوع میسلیوم، بایستی قسمت رویان هاگ ها را به ظروف کشت جدید منتقل نمود.
رسیدن به کشت خالص از آلودگی ها
پرورش دهنده، به طور انتخابی میسلیوم های خوب و بد را از همدیگر جدا کرده و بعد از مدتی کوتاه به کشت خالص و عاری از هر گونه آلودگی دست می یابد. در این مرحله نیز چنانچه آلودگی اندکی به چشم بخورد، بهتر است آن را از کلونی قارچ جدا کرد.
با توجه به این که بسیاری از آلودگی های متداول، ناشی از کپک های هاگزا می باشند، لذا باید مراقب بود تا محیط کشت را تکان نداده و یا کاری نکرد که باعث انتشار هاگ های این قبیل قارچها گردید.
همچنین باید از خنک بودن تیغ جراحی قبل از ورود آن به درون محیط آگار اطمینان حاصل کرد، زیرا یک تیغ و یا هر گونه وسیله داغ که به داخل آگار وارد می شود، باعث تولید بخار ناگهانی درون پتری دیش و در نتیجه موجب رهاسازی هاگ کپک های مجاور می شود.
نتایج کشت توده ای یا چندگانه هاگ قارچ
همان طور که در قبلا به آن اشاره شد در صورت عدم امکان تولید نژادی صد در صد خالص می توان با تهیه چندین کشت هاگ به ساده ترین صورت ممکن، یک نژاد نسبتا سالم و در خور استفاده تولید کرد.
در صورت جوانه زنی چنین توده هاگ، در واقع نژادهای متنوعی تولید می شود که بعضی از آنها با دیگران سازگاری نداشته و هر یک از آنها در شرایط مصنوعی آزمایشگاهی به لحاظ روش و مقدار محصول تفاوت زیادی با هم خواهند داشت.
چنین ترکیب غیر یکدست ژنتیکی می تواند، بر کل عملکرد ان محدود کننده ای داشته باشد. به این ترتیب که نژادهای کم بازده مانع فعالیت نژادهای پربازده دیگر می شوند. به طور کلی تنوع نژادی نتاج حاصل از کشت هاگ بالا بوده اما از نظر رفتاری، این گونه نتاج شباهت زیادی به والدین خود دارند، لذا چنانچه والدین آن اهلی شده و در شرایط آزمایشگاهی عملکرد خوبی داشته باشند، انتظار می رود که نتاج آنها نیز این گونه رفتار کنند.
در مقابل، گونه های وحشی در شرایط آزمایشگاهی ممکن است عملکرد بسیار کمی داشته باشند لذا در مورد آنها باید انتخاب (انفرادی یا توده ای) صورت گرفته و در نتیجه تنها اقدام به کشت گونه های پر محصول و خوب کرد.
رشد رویشی در هاگ ها به چه صورت است؟
از بین تعداد کثیری از نژادهای تازه ایجاد شده در کشت توده ای هاگها، ممکن است تنها اندکی از آنها قادر به رشد رویشی باشند. هر چند میسلیوم چنین قارچهایی قادر به جذب مواد غذایی و آب می باشند، اما توانایی تولید اندام باردهی (کلاهک) را ندارند.
به شبکه سلولی حاصل از یک هاگ که عموما هاپلوئید (n کوروموزومی) و واجد یک هسته می باشند. اصطلاحا مونوکاریون گویند. مونوکاریون ها معمولا فاقد توانائی تولید قارچهای بارور می باشند.
از برخورد و تلاقی دو مونوکاریون سازگار با هم، مواد سلولی و ژنتیکی آنها با یکدیگر مبادله شده و در نتیجه یک میسلیوم دو هسته ایجاد می شود که قادر به تولید نتاج بارور می باشد. به پنجه دوانی یا اتصال شبکه ای هیف ها یا میسلیومهای سازگار دو هسته ای با همدیگر اصطلاح جوش خوردن (اتصال) می گویند.
چنین فرآیندی در هر مرحله ای از تولید (آگار، روی اسپان و یا روی بستر کاشت) اتفاق می افتد. تلاقی نژادهای خویشاوند قارچ ها با هم، مشابه ایجاد گیاهان دورگه در باغبانی است.
کشت هاگ با رقیق سازی هاگ ها در محیط کشت
روش دیگر کشت هاگ، ایجاد ایزوله های تک هاگه (انفرادی و رقیق سازی هاگ ها با مقداری آب مقطر می باشد. محلول هاگ حاصل را می توان با انتقال آن به ظرف حاوی آب مقطر بیشتری، رقیق تر کرد که به نوبه خود از آن می توان برای تلقیح نهایی در ظروف کشت استفاده کرد.
پرورش دهنده با این روش می تواند هر یک از میسلیوم های جوان تک هسته ای را دیده و یک برنامه زمانبندی تلاقی منظمی را جهت توسعه نژادهای پر بازده تدوین نماید. این روش برای آن دسته از پرورش دهندگانی که مایل به انجام تلاقی های ساده بین نژادهای تک هسته و مطالعه بر روی خصوصیات نتاج حاصل از تلاقی می باشند ارزش زیادی دارد. توجه کنید که از هر ۱۰۰ گرم هاگ، بطور متوسط تنها ۱ تا ۵ عدد جوانه زده و رشد می کنند.
بزرگترین خطر تهدید کننده کشت های حاوی توده اسپور
بزرگترین خطری که متوجه کشت های توده اسپوری است، افزایش ضریب آلودگی به ویژه باکتریایی می باشد. بعضی از باکتریها دیواره سلولی میسلیوم ها را مورد حمله قرار داده، حال آن که دسته دیگری از آنها باعث تحریک جوانه زنی هاگ شده تا بعدا میسلیوم آن را مورد استفاده خویش قرار دهند.
از این رو، بعضی از نژادهای خویشاوند، بطور طبیعی بیمار بوده و آلودگی زیادی در پی خواهند داشت که در صورت جوانه زنی تودهای آنها، احتمال پخش آلودگی در محیط تشدید می شود. بسیاری از قارچ ها دارای یک رابطه همزیستی مناسبی (میکوریزها) با دیگر موجودات می باشند.
جوانه زنی هاگ های استریل شده
بعضی از باکتریها و مخمرها قادرند جوانه زنی هاگ هایی که در شرایط استریل و به تنهایی بسیار مشکل انجام می شود را تسهیل نمایند. اخیرا یک قارچ شناس سوئدی بنام فریس دریافته است که با افزودن مقداری زغال فعال (به میزان ۲ / 0 درصد حجمی) و مخمر قرمز به محیط کشت، می توان جوانه زنی را تسریع بخشید.
بنا به گزارش بسیاری از پرورش دهندگان، با اضافه شدن عمدی یا تصادفی بعضی از باکتریهای خاص به تعدادی از محیط های کشت، می توان رشد و نمو آنها را تشدید کرد. به طور مثال ثابت شده که باکتری های ازتوباکتر، باسیل و نوعی پزئودوموناس، اثر تحریک کنندگی بر انواع مختلف قارچ خوراکی و در مراحل مختلف رشد و نمو آنها (جوانه زنی هاگ ها، رشد میسلیومی، تولید کلاهک) دارند.
در هر صورت بیشتر عوامل باکتریایی و پرورش دهنده در پرورش قارچ با آنها مواجه است، مفید نبوده بطوری که آنها را می توان زیان بارترین رقیبان قارچ به شمار آورد. با رعایت دقیق نکات بهداشتی استفاده از صافی های بسیار ریز (هپا) و فناوری نوین آزمایشگاهی می توان تا حدی آنها را از محیط حذف کرد.
حفظ خاصیت ژنتیکی قارچ های خوراکی با استفاده از کشت بافت
کشت بافت، روش مطمئنی برای حفظ خاصیت ژنتیکی قارچ خوراکی است که طی آن نمونه بافت زنده را با حفظ خصوصیات والد آن تکثیر می کنند، حال آن که در کشت هاگ نژادهایی با خصوصیات جدید ایجاد می شوند.
نمونه بافت را باید از کلاهک هایی گرفت که ۲۴ تا حداکثر ۴۸ ساعت از چیدن آنها گذشته باشد و چنانچه از این حد فراتر رود، کلاهک خشک شده و یا خیلی پیر می شود که در آن صورت، بدست آوردن کشت خالص با مشکل همراه خواهد شد.
کشت سالم از کلاهک قارچ ها
با توجه به اینکه، کل کلاهک ترکیبی از میسلیوم های به هم فشرده است. لذا می توان از هر قسمت آن که بخواهید یک کشت سالم بدست آورید اما توصیه میشود که نمونه را بیشتر از لبه کلاهک یا زیر آن (حد فاصل محل اتصال ساقه تا لبه کلاهک از محل صفحه تیغه ها) بگیرید.
سپس پوسته کوتیکولی ضخیم روی آن را برداشته و از بافت گوشتی زیر آن نمونه دلخواه را گرفته سپس سطح آن را با یک پارچه نمدی آغشته به الکل، از هر گونه آلودگی احتمالی پاک نمایید.
آن گاه بلافاصله بعد از قرار دادن یک تیغ جراحی داغ داخل پتری دیش محتوی آگار (به منظور خنک کردن آن را داخل بافت هیفی قارچ فرو برده و قطعه کوچکی از آنرا جدا کنید.
سپس قطعه جدا شده را به سرعت داخل پتری دیش پر از ماده غذایی منتقل کرده و حتی الامکان بافت و محیط آگار را از تماس با هوا، دور نگاه دارید. این عمل را حداقل برای سه و ترجیحا پنج ظرف دیگر هم انجام دهید.
سپس روی هر ظرف برچسبی حاوی گونه، تاریخ و نوع بافت کشت شده و هم چنین نوع فرمول آگار مصرفی را بزنید. چنانچه این مرحله با موفقیت انجام شود، بعد از ۳ تا ۷ روز میسلیومها جوانه می زنند.
آستانه تحمل آلودگی محیط کشت به باکتری ها
آستانه تحمل آلودگی در اکثر سالن های تولید ۱۰٪ می باشد. با این وجود، معمولا در کشتهای اولیه که بطور مستقیم از بافت قارچ وحشی گرفته می شود این مقدار تا ۲۵٪ نیز می رسد که امری عادی است.
آلودگی های رنگ به رنگ و مختلفی اغلب در نزدیکی محل بافت انتقالی دیده میشود که تعداد آنها ارتباط نزدیکی با مقدار تمیز بودن بافت یا هاگ های انتقالی و وضعیت بهداشت کل آزمایشگاه دارد. در مجموع در کشت بافت، بیشترین آلودگی را باکتریها ایجاد می کنند.
آلودگی جزء جدایی ناپذیر محیط کشت قارچ می باشد. با افزایش آلاینده های باکتریایی بیش از آستانه تحمل 10% مشکلی زود هنگام و دامنه دار در آزمایشگاه بوقوع خواهد پیوست که باید هرچه زودتر به مبارزه با آن پرداخت.
چگونه انتقال به محیط کشت دوم را انجام دهیم؟
با ظهور علائم رشد در بافت، بایستی آن را به محیط کشت دیگری منتقل کرد که در صورت عدم آلودگی، انتقال سریع لزومی ندارد. اما در صورت تکثیر کلونی کپک در اطراف میسلیوم در حال رشد به سرعت محیط کشت میسلیوم را ایزوله نمایید، تا مبادا | مبتلا به کپک گردد.
بدیهی است جداسازی و ایزوله کردن میسلیوم ها از محیط کشت نیمه آلوده به مراتب از انتقال آنها از یک محیط خالص و سالم سخت تر است، زیرا اقدام به جداسازی میسلیوم قارچ از آلاینده نزدیک آن همراه با خطر انتشار و سرایت بیشتر آلودگی است.
گذشته از آن، نمیدانیم که زمان برداشتن درب پتری دیش آلوده، هاگ های کپک به بیرون سرایت می کنند یا خیر. بنابراین چنانچه پرورش دهنده هر چه زودتر کشت نیمه آلوده را شناسایی کرده و از شر آن خلاص شود، ایمن نگهداشتن مابقی کشت های خالص از آلودگی راحت تر می شود.
هم چنین به خاطر داشته باشید نژادی که از ظرف آلوده جدا کرده اید می تواند علیرغم ظاهر سالم مملو از آلودگی باشد که تنها در صورت تلقیح آن به بذور استریل در مرحله تهیه اسپان این آلودگی ظاهر می شود.
بهترین و موثرترین روش ها برای کاهش آلودگی در محیط کشت
جهت کاهش آلودگی در آزمایشگاه روش های زیادی وجود دارد که از آن جمله می توان به نصب صافی های بسیار ریز (هپا)، محفظه های شیشه ای استریل، سیستم تهویه ملایم هوا، ضدعفونی بودن هوای اتاق، پاکیزه بودن لباس و دستان فرد و غیره اشاره کرد.
در این زمینه به نکات ذیل توجه فرمایید:
- در مرحله اول، بهترین کار، ضدعفونی محیط کشت، آزمایشگاه، البسه، ابزار، ظروف و بویژه خود فرد است.
- بعد از انجام اعمال مرحله اول باید تمام تلاش خود را صرف حفظ تمیزی آن کنید. تنها کلونی های سالم را نگهداشته، مابقی ظروف آلوده و حتی نیمه آلوده را از سالن دور کنید.
محیط کشت آگار یکی از مهم ترین حلقه های زنجیره کاشت و پرورش قارچ خوراکی است. آگار یک پلی ساکارید با توده مولکولی بالاست که قدرت جذب آب را دارد و آن را معمولا با غلظت 0/8-0/6 % استفاده می نمایند.
اگر غلظت کمتر شود( 0/4 ٪)، محیط کشت خصوصا زمانی که PH هم پایین است، سفت نمی شود و اگر غلظت بالاتر (۱٪)انتخاب شود، محیط کشت خیلی سفت شده و در نتیجه جذب مواد غذایی توسط باف یا هاگ مشکل می شود. کشت خالص به منظور تهیه اسپان مورد نیاز برای تکثیر قارچ خوراکی را به دو روش می توان تهیه نمود. کشت هاگ، که به نوعی می توان آن را تکثیر جنسی نامید و دارای تفریق صفات و تنوع بالای نتاج حاصله از نظر کیفیت و کمیت محصول می باشد.
مشاهده تمامی محصولات فروشگاه
-_1_350x350.jpg)
11-(1)_350x350.jpg)
منابع مورد استفاده در مقاله روش های تهیه اسپان مورد نیاز برای تکثیر قارچ خوراکی
1-جعفرنیا. ساسان. راهنمای جامع و مصور پرورش قارچ های خوراکی. چاپ نهم. ویرایش دوم. 1395.
2-جعفرنیا. ساسان، خسروشاهی. سارا. کتاب جامع و مصور پرورش قارچ صدفی. چاپ پنجم. 1385.
3- جعفرنیا. ساسان، کرمی. مهدی. کتاب اصول و مبانی پرورش قارچ های خوراکی. 1388.
سلام برای محیط کشت استریل از چه ماده ای باید استفاده کنیم نممنون
سلام، وقتتون بخیر
منظور شما را دقیق متوجه نشدم! اگر منظور کشت بافت هست، که کار پیچیده ای است و از دستگاه اتوکلاو استفاده می شود.
اگر منظور برای کاشت نهال است، می‌توانید از محیط کشتهای آماده استریل کوکوپیت – پیت ماس استفاده کنید. برای اطمینان از استریل بودن هم از قارچ کشهای مسی یا فسفری یا گوگردی استفاده نمایید.